Il romanzo si apre nell’appartamento di Baker Street, dove il dottor Watson osserva l’amico Sherlock Holmes mentre si inietta cocaina, abitudine che usa per combattere la noia. Watson critica il suo comportamento, e i due discutono sul metodo deduttivo di Holmes.
Arriva Mary Morstan, una giovane donna preoccupata, che chiede aiuto a Holmes per un mistero legato al padre scomparso e a delle perle anonime che riceve ogni anno.
Mary racconta la sua storia: dieci anni prima, suo padre, un ufficiale dell’esercito, era scomparso dopo essere tornato dall’India. Da sei anni riceve ogni anno una perla preziosa per posta, senza mittente.
Ora ha ricevuto una lettera che le chiede di incontrare il mittente “in presenza di due amici fidati”. Holmes e Watson accettano di accompagnarla.
I tre partono di sera in carrozza verso una zona sconosciuta della città. L’atmosfera è cupa e misteriosa. Durante il tragitto, Mary racconta che il padre aveva un solo amico a Londra: il maggiore Sholto.
La tensione cresce mentre la carrozza li conduce in una casa isolata. Holmes resta vigile, Watson colpito dalla gentilezza di Mary (si intravede già l’inizio del suo interesse romantico).
I tre vengono accolti da Thaddeus Sholto, figlio del maggiore Sholto. È un uomo nervoso e bizzarro, che li conduce in una casa piena di oggetti orientali.
Rivela che il padre di Mary era suo amico, ma dopo un litigio su un tesoro trovato in India, il maggiore Sholto aveva nascosto il bottino e tradito i compagni d’avventura.
Thaddeus spiega che suo padre morì improvvisamente per un attacco di cuore, dopo aver visto apparire alla finestra la figura di un uomo con una gamba di legno.
Holmes, Watson, Mary e Thaddeus si recano nella casa del fratello di Thaddeus, Bartholomew Sholto, a Pondicherry Lodge.
La casa è chiusa e silenziosa. Entrano da una finestra e scoprono che Bartholomew è stato assassinato: ha una smorfia orribile sul viso e una spina avvelenata nel collo.
Vicino al corpo trovano un cofanetto vuoto (il tesoro è sparito) e un biglietto con la scritta “Il segno dei quattro”.
Holmes analizza il luogo con grande attenzione: trova impronte minuscole e tracce di un uomo con una gamba di legno.
Conclude che due persone sono entrate: un inglese zoppo e un complice indigeno molto piccolo, forse un nativo delle isole Andamane.
Holmes organizza un piano per rintracciarli e invia telegrammi alla polizia.
Holmes porta con sé Toby, un cane segugio, per seguire la pista dell’odore del creosoto (sostanza trovata sulla corda usata dai colpevoli).
Holmes e Watson inseguono la traccia fino al fiume Tamigi, dove scoprono che i fuggitivi sono scappati su una barca chiamata Aurora.
Holmes deduce che il ladro zoppo si chiama Jonathan Small e che il suo complice è Tonga, un indigeno delle Andamane.
Holmes chiede aiuto all’ispettore Athelney Jones di Scotland Yard.
Con astuzia, Holmes si traveste da marinaio e indaga nei cantieri navali per scoprire dove si trovi l’Aurora.
Watson, nel frattempo, si occupa di Mary Morstan, e tra i due nasce un sentimento tenero e sincero.
Holmes scopre che la barca è stata rimessa a nuovo con un altro nome. Organizza un inseguimento notturno sul fiume con la polizia.
Dopo una corsa mozzafiato, riescono a raggiungere i criminali: Tonga viene ucciso da un colpo di pistola, mentre Jonathan Small viene catturato.
Nella barca però non c’è traccia del tesoro: Small confessa di averlo gettato nel fiume, per impedirne l’uso da parte di altri.
Small racconta la sua storia: era un soldato in India e, insieme ad altri tre uomini (“il segno dei quattro”), aveva scoperto un immenso tesoro rubato.
Furono però arrestati e traditi da Sholto e Morstan, che presero il tesoro per sé. Dopo anni di prigionia alle Andamane, Small riuscì a fuggire con l’aiuto di Tonga per recuperare ciò che gli spettava.
La sua vendetta, però, si conclude tragicamente.
Il caso è risolto: il mistero del tesoro e della morte di Sholto è chiarito.
Holmes, pur soddisfatto della deduzione, rimane inquieto e si rifugia di nuovo nella cocaina.
Watson, invece, trova qualcosa di più prezioso del tesoro: l’amore di Mary Morstan, che diventerà sua futura moglie.
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